Inhoudsopgave:

Waarom is het nodig om PCR-producten te zuiveren voordat ze worden gesequenced?
Waarom is het nodig om PCR-producten te zuiveren voordat ze worden gesequenced?

Video: Waarom is het nodig om PCR-producten te zuiveren voordat ze worden gesequenced?

Video: Waarom is het nodig om PCR-producten te zuiveren voordat ze worden gesequenced?
Video: Proper PCR Cleanup before Sanger Sequencing - Seq It Out #12 2024, November
Anonim

Verificatie van de gewenste Product is essentieel , waaronder het bevestigen van een gebrek aan niet-specifieke producten en primerdimeren. Schoon -up van het reactiemengsel is ook vereist om niet-opgenomen primers en dNTP's te verwijderen die latere reacties kunnen verstoren en tot een onleesbare sequentie kunnen leiden.

Trouwens, waarom is het nodig om PCR-producten te zuiveren?

Jij moet PCR-producten zuiveren om ongebruikte primers, nucleotiden en enzymen kwijt te raken om het succes van ligatie te optimaliseren, waardoor de Product van PCR . Tot zuiveren de PCR-producten , wordt grootte-uitsluitingschromatografie gebruikt.

Men kan zich ook afvragen: moet u PCR-producten zuiveren vóór de vertering van restrictie-endonuclease? De meerderheid van beperking enzymen zijn actief in PCR buffers. Voor klonen, zuivering van PCR-producten voorafgaand aan vertering is vereist om het actieve thermofiele DNA-polymerase te verwijderen dat aanwezig is in de PCR mengsel. DNA-polymerasen kunnen de uiteinden van het gesplitste DNA veranderen en de opbrengst van ligatie verminderen.

Mensen vragen ook: hoe maak je PCR-producten klaar voor sequencing?

Directe sequentiebepaling van PCR-producten

  1. Zorg ervoor dat je het juiste fragment hebt versterkt.
  2. U moet alle resterende PCR-primers en niet-opgenomen nucleotiden verwijderen.
  3. Als de PCR-primers ook de sequencing-primer(s) zullen zijn, zorg er dan voor dat ze overeenkomen met onze voorwaarden.
  4. Concentreer het monster niet te veel!

Kun je het PCR-product sequencen?

direct Volgorde aanbrengen in van PCR-producten . Volgorde aanbrengen in gebruikt alleen een primer in plaats van de twee gebruikt in PCR . Als je dat doet verwijder niet beide primers, jij zal krijg er twee sequenties over elkaar heen gelegd die niet leesbaar zijn. Het is oké om een te gebruiken PCR primer voor volgorde aanbrengen in zolang het overeenkomt met onze voorwaarden.

Aanbevolen: